Nowa era w molekularnej biologii

Nowa era w molekularnej biologii: Precyzyjne poprawianie genomu metodą CRISPR/Cas9.

Opracowanie wydajnej i niezawodnej metody, aby uczynić precyzyjne i wycelowane zmiany w genomie żywych komórek jest odwiecznym marzeniem badaczy biomedycznych. Niedawno, znaczne podniecenie wywołało nowe narzędzie oparte na bakteryjnym białku Cas9 (CRISPR-associated protein-9 nuclease) ze Streptococcus pyogenes [1]. W ciągu wielu lat pojawiło się wiele prób manipulacji funkcją genu, w tym przez homologiczną rekombinację [2] i przez interferencyjne RNA (RNAi) [3]. RNAi w szczególności stało się głównym laboratoryjnym narzędziem umożliwiającym niedrogą i wydajną metodę przeegzaminowania funkcji genu [4,5], niemniej jednak metoda ta posiada ograniczenia przez dostarczanie jedynie czasowego hamowania funkcji genu, a także zewzględu na nieprzewidywalnych skutki uboczne [6]. Inne podejścia do opracowania wycelowanej modyfikacji genomu – nukleazy z palcami cynkowymi (ZFNs, zinc-finger nucleases)[7] i nukleazy efektorowe podobne do aktywatora transkrypcji (TALENs, transcription-activator like effector nucleases) [8] umożliwiały badaczom generowanie stałych mutacji przez wprowadzenie podwójnoniciowych pęknięć w DNA w celu aktywacji szlaku reparacyjnego. Te podejścia jednak są kosztowne i czasochłonne do wykonania, ograniczając ich szerokie stosowanie w szczególności w badaniach na wielką skalę i o wysokiej wydajności.

Biologia Cas9

U niektórych bakterii i arche, funkcje palindromicznych powtórzeń typu CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) i genów towarzyszących CRISPR

 

Rys. 1. Cas9 in vivo: Bakteryjna odporność adaptacyjna. W fazie pozyskania (ataku), obce DNA jest inkorporowane do bakteryjnego genomu w miejscu CRISPR. Wówczas miejsce CRISPR, wraz z obcym DNA ulega transkrypcji i procesingowi do crRNA podczas biogenezy crRNA. Podczas interferencji kompleks endonukleazy Cas9 z crRNA i oddzielnym tracrRNA przecina obce DNA zawierające 20-nukleotydową, komplementarną sekwencję crRNA sąsiadującą z sekwencji PAM (Protospacer-adjacent motif)(Rysunek nie jest narysowany w skali).

 

(Cas, CRISPR-associated) pełnią ważną rolę w adaptacyjnej odporności, dającej organizmowi możliwość odpowiedzi i eliminacji inwazyjnego materiału genetycznego. Początkowo te palindromiczne powtórzenia (CRISPR) odkryto u E. coli w latach 1980 [9], ale funkcji ich nie poznano aż do 2007 kiedy to Barrangou i współpracownicy, którzy wykazali, że S. thermophilus może uzyskać odporność na bakteriofagi przez integrację fragmentu genomu infekcyjnego wirusa w miejscu CRISPR [10].

Zostały zidentyfikowane trzy typy mechanizmów CRISPR, z których typ II jest najbardziej badany. W tym wypadku inwazyjne DNA z wirusów lub plazmidów jest cięte na małe fragmenty i wcielane w miejscu CRISPR między serią krótkich powtórzeń (ok. 20 bps). Miejsca te ulegają transkrypcji i wtedy transkrypty są procesowane dając małe RNA (crRNA , CRISPR RNA), które są używane do wskazania drogi dla efektorowych endonukleaz, które są wycelowane w inwazyjne DNA bazując na komplementarności sekwencji (Rys. 1)[11].

W eksperymentach z uszkodzeniem genu i jego ratowaniem wykazano, że jedno białko CAS, a mianowicie Cas9 (znane również jako Csn1) jest kluczowym graczem w pewnych mechanizmach CRISPR (specyficznie w układzie CRISPR typu II). Typ II mechanizmu CRISPR jest unikalnym mechanizmem w porównaniu z innymi układami CRISPR, jako że jedynie jedno białko Cas (Cas9) jest konieczne do wyciszenia genu [12]. W układach typu II, Cas9 uczestniczy w procesowaniu crRNA [12] i jest odpowiedzialne za destrukcję docelowego DNA [11]. Funkcja Cas9 w obu tych stopniach polega na obecności dwóch domen nukleazowych, domenie nukleazy podobnej do RuvC (RuvC-like nuclease) usytuowanej na N-końcu i domenie nukleazy podobnej do HNH (HNH-like nuclease), która jest zlokalizowana w regionie środkowym białka [13].

Aby osiągnąć rozpoznanie specyficznego miejsca na DNA i jego przeci ęcie, Cas9 musi być skompleksowana zarówno z crRNA, jak i oddzielnym aktywowanym trans crRNA (tracrRNA, lub trRNA, separate trans-activating crRNA), które jest częściowo komplementarne do crRNA [11]. To tracrRNA jest konieczne dla dojrzewania crRNA z pierwotnego transkryptu kodującego wiele pre-crRNA. To dojrzewanie odbywa się w obecności RNAseIII i Cas9 [12].

Podczas destrukcji docelowego DNA, obie domeny nukleazowe białka, a więc podobne do HNH i RuvC przecinają obie nici DNA, generując podwójnoniciowe pęknięcia (DSBs, double-stranded breaks) w miejscach definiowanych przez 20-nukleotydową sekwencję w obrębie towarzyszącego transkryptu crRNA [11,14]. Domena HNH przecina nić komplementarną, podczas gdy RuvC przecina nić niekomplementarną.

Podwójnoniciowa, endonukleazowa aktywność Cas9 również wymaga, aby krótka konserwatywna sekwencja (2-5 nukleotydów), znana jako motyw towarzyszący protospacerowi (PAM, protospacer-associated motif), następująca bezpośrednio zaraz za komplementarną sekwencją na końcu 3’ crRNA [15]. W rzeczywistości, nawet całkowicie komplementarna sekwencja jest ignorowana przez Cas9-RNA w nieobecności sekwencji PAM [16].

Cas9 i CRISPR jako nowe narzędzie biologii molekularnej.

Prostota nukleazy CRISPR typu II, z jedynie trzema komponentami (Cas9, crRNA i trRNA) czyni ten system skłonny do adaptacji do edytowania genomu. Douda i Charpentier [11] zdali sobie sprawę z ogromnego potencjału tego odkrycia. Opierając się na wcześniej opisanym układzie CRISPR typu II, autorzy opracowali uproszczony system dwu komponentów przez połączenie trRNA i crRNA z pojedynczą syntetyczną cząsteczką RNA pojedynczo nakierowaną (sgRNA, single guide RNA). Wykazano, że Cas9, zaprogramowane przez sarna jest co najmniej tak efektywna jak Cas9 programowane przez oddzielnie trRNA i crRNA w kierowaniu zmian w genie docelowym (Rys. 2A).

Do dziś trzy różne warianty nukleazy Cas9 zostały zaadaptowane w protokole edytowania genomu. Pierwszy jest Cas9 typu dzikiego, który może przecinać w specyficznym miejscu podwójnoniciowe DNA (DSB, double stand break), co aktywuje reperujący mechanizm. To pęknięcie DCB może być zreperowane przez komórkowy szlak NHEJ (Non-Homologous End Joining) niehomologicznego łączenia końców [17], skutkujący w inercji lub delecji (indels), który może zniszczyć w tym miejscu docelowy gen. Alternatywnie, jeśli dostarczymy matrycę donorową z homologią do docelowego miejsca, DSB może być zreperowane przez szlak HDR (homology-directed repair) reperacji kierowanej homologią, umożliwiając precyzyjną wymianę mutacji (Rys. 2A)[17,18].

Cong i współpracownicy [1] poszli krok dalej i zastosowali system Cas9 do zwiększenia precyzji przez opracowanie formy mutacji, znanej jako Cas9D10A, posiadającej jedynie aktywność nikazy, to znaczy aktywności posiadającej zdolność pęknięcia tylko jednej nici DNA i przez to nie aktywuje mechanizmu NHEJ. Zamiast tego, kiedy dostarczymy homologiczną matrycę do reperacji, reperacja DNA jest przeprowadzana z wysoką precyzją jedynie przez mechanizm HDR, co powoduje redukcję mutacji indel [1,11,19].

Zmutowane białko Cas9D10A jest jeszcze bardziej pożądane w sytuacji, kiedy miejsce docelowej mutacji jest przeprowadzane przez kompleksy Cas9 zaprojektowane do generacji pęknięć (nicks) sąsiedniego DNA [20] (Rys. 2B dostarcza więcej detali na temat aktywności „parowanej nikazy”).

Trzeci wariant jest białko Cas9, nie posiaające aktywności nukleazowej (dCas9 na Rys. 2C) [21]. Mutacja H940A w domenie HNH i D10A w domenie RuvC inaktywuje aktywność cięcia DNA, ale nie zapobiega wiązaniu DNA [11,22]. Z tego powodu wariant ten może być użyty do znalezienia miejsca o specyficznej sekwencji w dowolnym regionie genomu bez jego przecięcia. Zamiast tego, przez fuzję z różnymi domenami eżektorowymi, dCas9 może być użyte jako narzędzie do albo wyciszania genu lub do jego aktywowania [21,23-26]. Co więcej, to może być użyte jako narzędzie do wizualizacji. Na przykład, Chen i współpracownicy użyli fuzję dCas9 z białkiem fluorescencyjnym EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) do wizualizacji sekwencji powtarzających się w pojedynczym sarna lub niepowtarzających się miejsc używając transkrypt wielokrotnego sgRNA [27].

 

Rys. 2. Zastosowania systemu CRISPR

A. Nukleaza Cas9 typu dzikiego przecina podwójnoniciowe DNA w specyficznym miejscu aktywując mechanism reperacji podwójnociowego pęknięcia DNA (NHEJ, Non-Homologous End Joining). W nieobecności homologicznej matrycy do reperacji DNA, niehomologiczne łączenie końców może powodować insercje/delecje (indel), które mogą zniszczyć sekwencję docelową. Alternatywnie, można wykonać precyzyjne mutacje i wstawki przez dostarczenie homologicznej matrycy i wykorzystanie homologicznego bezpośredniego mechanizmu reperacji (HDR, homology-directed repair). B. Zmutowana nukleaza Cas9 powoduje specyficzne w stosunku do miejsca pęknięcia w jednej z nici DNA (nicks ). Dwa sgRNA mogą być użyte dla wprowadzenia naprzemiennego podwójno-niciowego pęknięcia, które podlega reperacji kierowanej przez homologię. C. Zmutowany Cas9, nieposiadajacy aktywności przecinania DNA może być połączony (ulec fuzji) z różnymi domenami efektorów umożliwiającymi specyficzną lokalizację. Takimi efektorami mogą być aktywatory lub represory transkrypcji, a także białka fluoroscencyjne.

Sprawa wydajności i niechcianych mutacji

Porawianie wydajności, lub procentu osiągnięcia pożądanych mutacji, jest jednym z najważniejszych parametrów w ocenie narzędzi edytowania genomu. Patrząc na wydajność Cas9 porównujemy ten system ze znanymi metodami, takimi jak TALEN lub ZFN [8]. Na przykład w komórkach ludzkich, zaprojektowana modyfikacja z użyciem metody ZFN lub TALEN może być osiągnięta z wydajnością 1-50% [29-31]. W przeciwieństwie do tego, system Cas9 umożliwia osiągnięcie żądanej mutacji z wydajnością powyżej 70%, u ryby Danio [32], w roślinach [33] i w granicach 2-5% w indukowanych komórkach macierzystych [34]. Dodatkowo, Zhou i współpracownicy byli w stanie podnieść wydajność do 78% w jednokomórkowym zarodku myszy i osiągnęli wydajną transmisję zarodkową przez użycie dwóch sgRNA do jednoczesnej zmiany indywidualnego genu [35].

Szeroko stosowana metoda identyfikacji mutacji to test detekcji z użyciem T7 endonukleazy I [36,37] (Rys. 3). Test ten wykrywa heterodupleks DNA, który powstaje w wyniku hybrydyzacji nici DNA, posiadającą żądaną mutację z nicią DNA typu dzikiego [37]. 

 

Rys. 3. Test wydajności docelowej mutacji za pomoca T7 endonukleazy I.

Genomowe DNA jest powielone metodą PCR przy pomocy primerów optaczających modyfikowane miejsce. Produkty PCR są następnie denaturowane i powtórnie hybrydyzowane dając trzy możliwe struktury. Dupleksy zawierające mutacje są trawione przez T7 endonukleazę I. Po tym trawieniu DNA jest poddawane elektroforezie i oddzielane, a fragmenty analizowane w celu określenia wydajności celowej mutacji.

Innym ważnym parametrem jest zdarzenie niechcianej (off-target) mutacji. Takie mutacje mogą powstawać prawdopodobnie w miejscach, które posiadają różnice jedynie kilku nukleotydów w porównaniu do sekwencji pierwotnej, a mogą powstać o ile znajdują się one w sąsiedztwie do sekwencji PAM. Jest to spowodowane faktem, że Cas9 może tolerować niedokładność (mismatch) sekwencji sięgającą aż 5-ciu zasad wewnątrz regionu „protospacer” [36] lub różnicę jednej zasady w sekwencji PAM [38]. Niechciane mutacje jako skutek uboczny ogólnie jest trudno wykryć, co wymaga zsekwencjonowania całego genomu, aby je całkowicie wykluczyć.

Niedawne ulepszenia w systemie CRISPR wprowadzone, aby zredukować niechciane mutacje zostały zrobione przez użycie krótszego gRNA (skróconego w obrębie sekwencji pochodnej cRNA) lub przez dodanie dwóch dodatkowych nukleotydów guaninowych (G) na końcu 5’ [28, 37]. Innym sposobem, którym próbowano minimalizować efekt niechciany (off-target) jest użycie „paired nickases” [20]. Strategia ta używa D10ACas9 i dwa sgRNA komplementarne do sąsiedniego obszaru na przeciwnych niciach miejsca docelowego (Rys. 2B). Pomimo że to indukuje DSB na DNA docelowym, to zakłada się, że spowoduje to tylko pojedyncze pęknięcie w lokalizacji poza miejscem docelowym i w ten sposób skutkuje minimalnymi mutacjami niechcianymi (off-target).

Przez komputerowe wspomaganie w redukowaniu mutacji niechcianych, wiele grup opracowało narzędzia z użyciem sieci internetowej dla ułatwienia identyfikacji potencjalnych miejsc docelowych dla CRISPR i oceny ich potencjalnego przecięcia poza miejscem docelowym. Przykłady te obejmują CRISPR Design Tool [38] i ZiFiT Targeter, Version 4.2 [39,40].

Aplikacje jako narzędzia edytowania genomu i namierzanie genomu.

W następstwie początkowej demonstracji w 2012 roku [9], system CRISPR/Cas9 znalazł szerokie zastosowanie. System ten został z sukcesem użyty w namierzeniu ważnych genów w wielu liniach komórkowych i organizmach, w tym ludzkich [34], bakteryjnych [41], ryby Danio (zebrafish) [32], C. elegans [42], roślin [34], Xenopus tropicalis [43], drożdży [44], Drosophila [45], małp [46], królika [47], świni [42], szczura [48], i muszy [49]. Kilka grup badaczy wykorzystało tę metodę do wprowadzenia pojedynczych mutacji (delecji lub insercji) do poszczególnego genu docelowego poprzez pojedynczy gRNA [14,21,29]. Używając zamiast tego nukleazę Cas9 kierowaną przez parę gRNA, to jest również możliwe, aby indukować duże delecje lub rearanżację genomu, takie jak inwersje, lub translokacje [50]. Niedawne podniecającym opracowaniem jest użycie wersji dCas9 w systemie CRISPR/Cas9 do kierowania domeny białka w regulacji transkrypcji [26,51,52], epigenetycznej modyfikacji [25] i wizualizacji mikroskopowej specyficznego miejsca na genomie [27].

System CRISPR/Cas9 wymaga jedynie powtórnego opracowania crRNA, tak aby zmienić specyficzność docelową. Taka korzyść jest przeciwieństwem innych narzędzi edytujących geny, w tym stosujących palce cynkowe i TALEN, gdzie wymagane jest powtórne opracowanie interfejsu białko-DNA. Co więcej, CRISPR/Cas9 umożliwia szybkie przeegzaminowanie całego genomu w celu znalezienia funkcji genu przez wygenerowanie dużej biblioteki gRNA [51,53] w celu przesiewowego badania genomu.

Przyszłość CRISPR/Cas9

Dzięki prostocie, wysokiej wydajności i zróżnicowaniu systemu nastąpił ogromny postęp w rozwoju Cas9 w kierunku zestawu narzędzi dla badań biologii komórkowej i molekularnej. Z powodu możliwości systemu nukleazy obecnie dostępny w precyzyjnej inżynierii genomu, potencjał systemu CRISP/Cas9 sięga poza przecinanie DNA i jego użyteczność w rekrutacji białka do specyficznego miejsca na genomie prawdopodobnie jest ograniczone jedynie przez naszą wyobraźnię.

Piśmiennictwo

1. Cong L., et al. (2013) Science, 339, 819–823.
2. Capecchi, M.R. (2005) Nat. Rev. Genet. 6, 507–512.
3. Fire, A., et al. (1998) Nature, 391, 806–811.
4. Elbashir, S.Mm, et al. (2002) Methods, 26, 199–213.
5. Martinez, J., et al. (2003) Nucleic Acids Res. Suppl. 333.
6. Alic, N, et al. (2012) PLoS One, 7, e45367.
7. Miller, J., et al. (2005) Mol. Ther. 11, S35–S35.
8. Mussolino, C., et al. (2011) Nucleic Acids Res. 39, 9283–9293.
9. Ishino, Y., et al. (1987) J. Bacteriol. 169, 5429–5433.
10. Barrangou, R., et al. (2007). Science, 315, 1709–1712.
11. Jinek, M., et al. (2012) Science, 337, 816–821.
12. Deltcheva, E., et al. (2011) Nature, 471, 602–607.
13. Sapranauskas, R., et al. (2011) Nucleic Acids Res. 39, 9275–9282.
14. Nishimasu, H., et al. (2014) Cell, doi:10.1016/j.cell.2014.02.001
15. Swarts, D.C., et al. (2012) PLoS One, 7:e35888.
16. Sternberg, S.H., et al. (2014) Nature, doi:10.1038/nature13011.
17. Overballe-Petersen, S., et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110,19860–19865.
18. Gong, C., et al. (2005) Nat. Struct. Mol. Biol. 12, 304–312.
19. Davis, L., Maizels, N. (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 111, E924–932.
20. Ran, F.A., et al. (2013) Cell, 154, 1380–1389.
21. Qi, L.S., et al. (2013) Cell, 152, 1173–1183.
22. Gasiunas, G., et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 109, E2579–2586.
23. Maede, M.L., et al. (2013) Nat. Methods, 10, 977–979.
24. Gilbert, L.A., et al. (2013) Cell, 154, 442–451.
25. Hu, J., et al. (2014) Nucleic Acids Res. doi:10.1093/nar/gku109.
26. Perez-Pinera, P., et al. (2013) Nat. Methods, 10, 239–242.
27. Chen, B., et al. (2013) Cell, 155, 1479–1491.
28. Seung, W., et al. (2014) Genome Res. 24, 132–141.
29. Miller, J.C., et al. (2011). Nat. Biotechnol. 29, 143–148.
30. Mussolino, C., et al. (2011). Nucleic Acids Res. 39, 9283–9293.
31. Maeder, M.L., et al. (2008) Mol. Cell, 31, 294–301.
32. Hwang, W.Y., et al. (2013) PLoS One, 8:e68708.
33. Feng, Z., et al. (2013) Cell Res. 23, 1229–1232.
34. Mali, P., et al. (2013) Science, 339, 823–826.
35. Zhou, J., et al. (2014) FEBS J. doi:10.1111/febs.12735.
36. Fu, Y., et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31, 822–826.
37. Fu, Y., et al. (2014) Nat Biotechnol. doi: 10.1038/nbt.2808.
38. Hsu, P.D., et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31, 827–832.
39. Sander, J.D., et al. (2007) Nucleic Acids Res. 35, W599-605.
40. Sander, J.D., et al (2010) Nucleic Acids Res. 38, W462–468.
41. Fabre, L., et al. (2014) PLoS Negl. Trop. Dis. 8:e2671.
42. Hai, T., et al. (2014) Cell Res. doi: 10.1038/cr.2014.11.
43. Guo, X., et al. (2014) Development, 141, 707–714.
44. DiCarlo, J.E., et al. (2013) Nucleic Acids Res. 41, 4336–4343.
45. Gratz, S.J., et al. (2014) Genetics, doi:10.1534/genetics.113.160713.
46. Niu, Y., et al. (2014) Cell, 156, 836–843.
47. Yang, D., et al. (2014) J. Mol. Cell Biol. 6, 97-99.
48. Ma, Y., et al. (2014) Cell Res. 24, 122–125.
49. Mashiko, D., et al. (2014) Dev. Growth Differ. 56, 122–129.
50. Gratz, S.J., et al. (2013) Fly, 249.
51. Mali, P., et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31, 833–838.
52. Cheng, A.W., et al. (2013) Cell Res. 23, 1163–1171.
53. Koike-Yusa, H., et al. (2013) Nat. Biotechnol. doi: 10.1038/nbt.2800.
54. Sander, J.D., and Joung, J.K. (2014) Nat Biotechnol. doi:10.1038/nbt.2842.

From NEB expressions Issue I, 2014
Article by Alex Reis, Ph.D., Bitesize Bio
Breton Hornblower, Ph.D., Brett Robb, Ph.D. and George Tzertzinis, Ph.D., New England
Biolabs, Inc.

https://www.neb.com/tools-and-resources/feature-articles/crispr-cas9-and-targeted-genome-editing-a-new-era-in-molecular-biology#!

Wybrane aktualne publikacje:

Pulecio J, Verma N, Mejía-Ramírez E, Huangfu D, Raya A. 2017. CRISPR/Cas9-Based Engineering of the Epigenome. Cell Stem Cell. 21(4): 431-447.

Maxwell KL. 2017. The Anti-CRISPR Story: A Battle for Survival. Mol Cell. 68(1): 8-14.

Hess GT, Tycko J, Yao D, Bassik MC. 2017. Methods and Applications of CRISPR-Mediated Base Editing in Eukaryotic Genomes. Mol Cell.  68(1): 26-43.

Murugan K, Babu K, Sundaresan R, Rajan R, Sashital DG. 2017. The Revolution Continues: Newly Discovered Systems Expand the CRISPR-Cas Toolkit. Mol Cell.  68(1): 15-25.

Zhang Y, Mu W, Wang H. 2017. Gene editing in T cell therapy. J Genet Genomics.  44(9): 415-422.

Liu C, Zhang L, Liu H, Cheng K. 2017. Delivery strategies of the CRISPR-Cas9 gene-editing system for therapeutic applications. J Control Release. 266: 17-26.

Jamal M, Ullah A, Ahsan M, Tyagi R, Habib Z, Khan FA, Rehman K. 2017. Treating Genetic Disorders Using State-Of-The-Art Technology. Curr Issues Mol Biol. 26: 33-46.

Gundry MC, Dever DP, Yudovich D, Bauer DE, Haas S, Wilkinson AC, Singbrant S. 2017. Technical considerations for the use of CRISPR/Cas9 in hematology research. Exp Hematol. 54: 4-11.

Kwarteng A, Ahuno ST, Kwakye-Nuako G. 2017. The therapeutic landscape of HIV-1 via genome editing. AIDS Res Ther. 14(1): 32.

Wang HX, Li M, Lee CM, Chakraborty S, Kim HW, Bao G, Leong KW. 2017. CRISPR/Cas9-Based Genome Editing for Disease Modeling and Therapy: Challenges and Opportunities for Nonviral Delivery. Chem Rev. 117(15): 9874-9906.

Mei Y, Wang Y, Chen H, Sun ZS, Ju XD. 2016. Recent Progress in CRISPR/Cas9 Technology. J Genet Genomics. 43(2): 63-75.

Yang HC, Chen PJ. 2017. The potential and challenges of CRISPR-Cas in eradication of hepatitis B virus covalently closed circular DNA. Virus Res. 2017 Jun 13. pii: S0168-1702(17) 30279-4.