Wywiad dr Mercoli z dr Wakefieldem

Z powodu cenzury, jaką stosuje YouTube i usunięciu wstrząsającego filmu Wyszczepieni,

Wyszczepieni film dr Wakefielda / VAXXED / PL

https://www.youtube.com/watch?v=dOw95XE5wkM#! Usunięty!!!!

postanowiłem poszukać w Internecie tego filmu, który znalazłem i cytuję go poniżej. Niemniej jednak podczas poszukiwań natknąłem się na wywiad dr Mercoli (autora m.in. książki "Dieta bez zbóż") z dr Wakefieldem,

Wywiad dr Mercoli z dr Wakefieldem na temat jego badań nad MMR - napisy PL

https://youtu.be/QWWqpXQLMOY#!

który dla mnie był ważny z kilku powodów, w. in. dr Wakefield mówi bezpośrednio o połączeniu autyzmu z glutenem i szczepionką MMR. Dla mnie połączenie to od dawna było oczywistością, a to ze względu na fakt, że przeciwciała przeciw tkankowej transglutaminazie (TG2) (złoty marker w diagnozie celiakii) blokują przekazywanie sygnałów przez oksytocynę, odpowiedzialne m.in. za problemy z afiliacją, znajdywaniem partnera, zaufaniem, etc. - ogólnie za autyzm. Obejrzawszy filmy z dr Wakefieldem (Usłyszeć ciszę i Wyszczepieni), zadawałem sobie pytanie, czy eksponencjalny wzrost diagnozy autyzmu w ostatnich latach, a opisywany w prestiżowym czasopiśmie Nature (2011)

jest spowodowany szczepionkami, czy glutenem. Jestem niezmiernie wdzięczny dr Wakefiledowi za to, że - w kontekście szczepionek - wspomniał o glutenie.

Innym aspektem, na który zwróciłem uwagę, słuchając tego wywiadu, była niesłychana pryncypialność dr Wakefielda w obronie człowieka, wraz z jego prawami jako podmiotu, 

jego (dr Wakefielda) nieprawdopodobna kultura i skromność połączona z ogromną wiedzą; obronie praw człowieka, a zwłaszcza dzieci i ich rodziców, w zderzeniu z brutalnością wielkich firm farmaceutycznych, korumpowaniem ludzi na najwyższych szczeblach hierarchii państwa, nauki i medycyny, przenikaniem się struktur państwa, które powinny stać na straży naszego bezpieczeństwa, a także rzetelności i czystości nauki, z firmami wielkiej farmacji. Wierność Wakefielda zasadom, etyce, pomimo ataków ze strony mediów, sądów, władzy, pomimo utraty prestiżowej pracy, zasługuje na najwyższe uznanie. A zgnilizna na najwyższych szczeblach jest po prostu powalająca i okazuje się, że nie tylko w Wielkiej Brytanii, czy USA, ale również i u nas i to w trakcie „dobrej zmiany” a.d. 2017, której przejawem jest skandaliczna uchwała naszego Sejmu, podpisana przez prezydenta Andrzeja Dudę, wprowadzająca przymus szczepienia dzieci m.in. szczepionką MMR. Kto podsunął ten szatański pomysł? Big Pharma?

Poniżej cytuję wspomniane dwa filmy z Wakefieldem

Usłyszeć ciszę

https://youtu.be/5OY2KnQ5or0#!

Wyszczepieni – od TUSZOWANIA faktów do KATASTROFY

http://szczepienia.wybudzeni.com/2016/08/31/wyszczepieni-od-tuszowania-faktow-katastrofy/#!

Nauka alternatuwna: Rozumiem, rozumiem... nic nie rozumiem!

 

Wiele rzeczy zaczynamy rozumieć późno.

Jeszcze więcej –bardzo późno.

Najwięcej – zbyt późno.

Ryszard Kapuściński

Wariat to ten co krąży poza wiedzy miedzą

i pierwszy powie to czego inni nie wiedzą

Prof. Mariusz Jędrysek-Orion

Magnes neodymowy i miedziana rura - Neodymium magnet and copper pipe

https://youtu.be/6iqiFnTNBeM#!

POCUS urządzenie wytwarzające energię bez zużycia paliwa

https://youtu.be/dUkdGWDXnog#!

REWOLUCJA ENERGETYCZNA: pierwsza publiczna prezentacja reaktora Magrav Keshe'a. Łańcuch Życia 3

https://youtu.be/n_3vlzVhKL0#!

"Technologia Obcych" - film dokumentalny. Lektor PL

https://youtu.be/vRT3uEm2KGc#!

Nauka alternatywna - darmowa energia

Wiele badań i odkryć w zasadzie występuje jako nauka alternatywna, sekowana przez oficjalną naukę. Przykładów można mnożyć i to z dziedziny fizyki, biomedycyny i innych; o niektórych wspomniałem w tym blogu. Przypomnę tu zaledwie kilka:

• Neurofon (Neurophone),
• EM Drive,
• Jack Andraka (diagnoza raka trzustki),
• Evangelos Michelakis (DCA, lek przeciwrakowy),
• Denis Faustman (regenreacja wysp Langerhansa i wyleczenie cukrzycy),
• William Kelly (leczenie raka).

Poniżej zacytuję ciekawy artykuł na temat energii:

Jak to jest z darmową energią?

http://alexjones.pl/aj/aj-technologia-i-nauka/aj-energia/item/113708-jak-to-jest-z-darmowa-energia#!

23 kwiecień 2017

Istnieje wiele rozwiązań technicznych pozwalających czerpać bez ograniczeń energię z naszego otoczenia, jednak wszystkie te wynalazki są skutecznie blokowane przez sektor finansowy i energetyczny, oraz rządy państw bojące się utraty kontroli nad społeczeństwami.

Nie jestem przesadnym zwolennikiem teorii spiskowych – ani w nauce i zastosowaniu badań w przemyśle, ani w polityce. Każdy czytelnik po przeczytaniu tego zdania pomyśli zapewne: „Twierdzi, że nie wierzy w spiski, ale coś jest na rzeczy, bo inaczej by o tym nie pisał..." – i w zasadzie będzie miał rację! Bo choć nie należy mnożyć bytów ponad miarę i potrzebę (teoria rzecze Williama z Ockham, angielskiego franciszkanina żyjącego w latach 1300–1349, która w większości przypadków się sprawdza), to jednak trudno nie zadać sobie prostego pytania:

Dlaczego do dziś korzystamy ze sposobów wytwarzania (i przetwarzania) energii, które należą właściwie do

XIX wieku i wcześniejszych (z jednym niechlubnym wyjątkiem – energetyką jądrową)?

Pytanie jest proste i odpowiedź dla osób w miarę uważnie obserwujących środowisko obecnego homo sapiens w jest zasadzie również prosta: bo ludzie są chciwi, a im bardziej są bogaci, oraz im większą dzierżą władzę, tym bardziej są boją się jej utraty.

Przy czym ta konstatacja wymaga rozwinięcia.

WYTWARZANIE ENERGII DZISIAJ

Może to się wydać dziwne, a nawet zabawne — w zasadzie nie odeszliśmy daleko od ogniska wędrownego łowcy – energię uzyskujemy w większości ze spalania różnych materiałów. Od tego schematu odbiega trochę wykorzystanie energii wody (elektrownie wodne) i wiatru.

Niewątpliwie nieco dalej od naszego ogniska plasuje się energetyka jądrowa. Ale trudno ją nazwać wielkim osiągnięciem, bo w rachunku ciągnionym nie jest taka tania, a po drugie niesie ze sobą trudne do oszacowania zagrożenie ekologiczne. Wystarczy jakiś duży, aczkolwiek z punktu widzenia przetrwania naszego gatunku niegroźny, kataklizm, który w przypadku uszkodzenia kilku elektrowni atomowych może zmienić się w kataklizm ostatecznie kładący kres panowaniu człowieka na Ziemi. Być może dla tej ostatniej wyszłoby

to na dobre. Na przykład solidne trzęsienie ziemi w terenie „sejsmicznie bezpiecznym" i bum... nawet strach myśleć o konsekwencjach. W końcu wystarczyła jedna Fukushima, aby zagrozić życiu wszystkich stworzeń morskich w Oceanie Spokojnym (na razie).

W rzeczy samej wszystkich wielbicieli energetyki jądrowej należałoby moim zdaniem przymusowo kwaterować w osiedlach mieszkalnych gdzieś w pobliżu składów zużytego paliwa. Choć nie, nawet najgorszemu wrogowi nie należy tego życzyć, W końcu oni mają jedynie ograniczoną wyobraźnię. Cóż, za taki defekt psychiczny nie wypada znęcać się nad mądrymi inaczej.

Inne metody (wykorzystujące energię wiatru, słońca) stanowią mniejszość. Oczywiście nie można nie doceniać postępu w poszczególnych segmentach (na przykład spalanie fluidalne), oraz innych znakomitych rozwiązań, takich jak pompy ciepła lub pompy kawitacyjne, jednak należy zwrócić uwagę na to, że wszystkie te metody wymagają pośredniego lub bezpośredniego zasilania paliwami (surowce!) lub energią elektryczną (w większości surowce!).

Niewątpliwie krokiem w dobrym kierunku jest poszukiwanie energii z tak zwanych źródeł odtwarzalnych (metan uzyskiwany z odpadów organicznych, rośliny szybko rosnące przeznaczone do opalania, wykorzystywanie słomy zbóż), lecz są to metody mające ścisłe powiązanie z konkretnym miejscem i nie zawsze możliwe do zaadaptowania w innych.

A co więcej, każda z nich może być reglamentowana bądź koncesjonowana przez państwo i...radośnie przez to państwo opodatkowana. Może zmienić się nastawienie polityczne — ot, np. obecny rząd jakoś nie kocha turbin wiatrowych.

GDZIE TEN POSTĘP?

Prawdziwy postęp w jakiejkolwiek dziedzinie związany z odkryciami nowych zjawisk tworzony przez jednostki (Tesla, Marconi) bądź zespoły badawcze tworzone przez te jednostki (Edison) zostaje wtłoczony w ramy badań finansowanych przez państwo bądź prywatne i bogate firmy (korporacje). To jest już „postęp sterowany i ukierunkowany", w którym nie ma miejsca dla osób negujących obowiązujące teorie, nie mówiąc o „podstawowych prawach nauki". Przynajmniej w sferze jawnej.

Wszyscy indywidualnie i nieszablonowo myślący odszczepieńcy mogą co najwyżej zejść do piwnicy, a niektórym pozwoli się, ewentualnie, podziałać piętro wyżej, czyli w garażu. Takie mechanizmy obecnej nauki – może w trochę innej dziedzinie –pięknie pokazuje książka Zakazana archeologia Michaela Cremo i Richarda Thompsona.

KRÓTKA WYCIECZKA OBJAZDOWA PO GARAŻACH

Zajrzyjmy do tych garaży i zobaczmy, jakie to bezeceństwa tam się wyprawia. Pierwszy etap podróży to Australia.

To właśnie tam garażowy wynalazca zbudował silnik napędzający kosiarkę, który działał na... wodę.(1) Któregoś dnia wrócił do domu, rzucił rodzinie na stół milion dolarów, czy coś koło tego, a potem stwierdził, że nie chce już więcej gadać ani słyszeć o swoich maszynkach. Jakiś czas później ktoś odstrzelił mu głowę z dubeltówki w drzwiach wejściowych jego własnego domu. Podejrzewa się, że kupiec rozwiązania na wszelki wypadek zlikwidował potencjalne źródło „przecieku informacji”.

Pozostańmy w kraju z Krzyżem Południa na fladze. W czasopiśmie Melbourne Age z 13 lipca 1993 roku na 5 stronie opisano „system bezpiecznej produkcji ozonu" – małe czarne pudełeczko zmniejszało spalanie paliwa w samochodach o dwie trzecie. Pracownicy Agencji Ochrony Środowiska wspólnie z naukowcami z Uniwersytetu Swinburn potwierdzili w prywatnych (sic!) rozmowach z wynalazcą, że jest to najlepsze rozwiązanie tego typu, z jakim się spotkali. Wynalazcą był niejaki Mike Holland, który założył firmę „Oz Smart

Technologies". Chwalił się, że jego rozwiązaniem zainteresowani byli wojskowi, a Nissan dawał mu pięć milionów dolarów.

Mamy rok 2017. I co? Było dość czasu, aby wykorzystać to dość skuteczne rozwiązanie oszczędzające paliwo. Czy mamy jakiś przewrót technologiczny? Czy poprawił się stan naszych kieszeni (dla tych, którzy jeszcze nie załapali, wyjaśniam, że użytkownicy samochodów płaciliby mnie więcej o 100 zł mniej przy napełnianiu baku)? Czy ma to wpływ na ekonomię kraju? Odpowiedź wpisuje się wspaniale w tradycję odpowiedzi ekspedientek sklepów mięsnych z czasów stanu wojennego: NIE MA. Zresztą nie oszukujmy się — państwu zależy na tym, aby paliwa były jak najdroższe, a samochody paliły dużo — w końcu kasuje 50% ceny w formie akcyzy i podatku. Skarb Państwa ma duże potrzeby i stale za mało pieniędzy.

„Oz Smart Technologies" nie istnieje, a Mike Holland rozpłynął się w upalnym, falującym powietrzu australijskich pustkowi.(2)

Przenieśmy się teraz na inny kontynent, cofając się kilkadziesiąt lat wstecz. Najpierw frustrujący przykład mieszanki niekompetencji i thrillera. W latach trzydziestych ubiegłego stulecia niejakiemu Henry'emu T. Morayowi odmówiono udzielenia patentu na “zimną katodę półprzewodnikową", ponieważ urzędnik udzielający patentu nie potrafi! zrozumieć (sic!), w jaki sposób może ona emitować elektrony (to była niekompetencja). Wynalezienie dwadzieścia lat później tranzystora udowodniło, że urządzenie Moraya mogło działać.

Naiwny i prostoduszny wynalazca nie poddał się i w roku 1940 zaprezentował przed członkami Komisji ds. Użyteczności Publicznej (Public Utilities Commission) generator „darmowej" energii, który wytwarzał na wyjściu napięcie 250 000 V (dwieście pięćdziesiąt tysięcy V). Ot, taka energia z niczego. Następnego dnia ktoś go zastrzelił w laboratorium i zabrał wszystkie notatki oraz rzeczony generator (a to był właśnie wspomniany thriller).(3)

Powędrujemy w czasie nieco do przodu. Chemik John Andrews zaprezentował w roku 1974 przedstawicielom marynarki wojennej USA dodatek do wody, który zamieniał ją w paliwo. Zarzucano mu nawet oszustwo, ale obronił się na zamkniętym posiedzeniu sądu. Według jego szacunków pozwoliłby on na obniżenie ceny 1 litra benzyny do pół centa (½ ¢). Kiedy przedstawiciele marynarki wojennej wybrali się do niego w celu wynegocjowania zakupu technologii i receptury, zastali w laboratorium ogromny bałagan, zaś sam chemik „zaginął”. O tym wynalazku Nexus wspominał parę lat temu.

W lipcu tego samego roku prokurator okręgowy z Los Angeles. działając na „polecenie z góry”, najechał warsztat Eda Graya i skonfiskował prototyp generatora wytwarzającego darmową energię (free energy) wraz z całą dokumentacją. Wysunął przy okazji różne bezpodstawne zarzuty przeciw Grayowi i skutecznie utrącał wszelkie usiłowania jego adwokatów dążących do odzyskania skonfiskowanych rzeczy. W wyniku tych działań Ed Gray został w końcu zmuszony do ogłoszenia bankructwa.

Właściwie można by tak bez końca… ot, choćby Howard Johnson (USA) walczył sześć lat z Urzędem Patentowym o przyznanie patentu na silnik oparty na stałych magnesach(4). Kohei Minato (Japonia), który opracował silnik działający na podobnych zasadach, musiał wprowadzić zmiany w swoim patencie dodając elektromagnesy zasilane niewielkim prądem, bo przecież silnik bez zasilania, to nie silnik!(5)

Długo by opowiadać o urządzeniach zmniejszających znacznie zużycia paliwa, o generatorach darmowej energii tworzonych w garażach i innych fascynujących rozwiązaniach, których twórcy boją się je ujawniać, a jeśli już to zrobią, to są zastraszani, doprowadzani do bankructwa, pomieszania zmysłów bądź wymazywani z naszej rzeczywistości przy pomocy lupary (sycylijska nazwa „obrzyna”).

Można by wiele o wynalazkach mogących zmienić nasze życie na łatwiejsze i spowodować, że energia byłaby dostępna w każdym miejscu i w każdej ilości, bez potrzeby przesyłania jej na znaczne odległości.

Nasuwa mi się tu również na myśl patent Josepha Pappa, Węgra, uciekiniera z komunistycznego raju po gwałtownej erupcji uczuć Armii Radzieckiej wobec Węgrów w roku 1956. Ówże Papp skomponował sprytną mieszankę gazów szlachetnych, która po potraktowaniu jej impulsem elektrycznym zmieniała swoją objętość, po czym wracała do stanu wyjściowego. Papp opracował rozwiązanie, w którym pojemniki z tą mieszanką zostały umieszczone w cylindrach silnika samochodowego. Według słów wynalazcy pojemniki z gazem wymagały regeneracji co 90 tysięcy kilometrów.(6) Wyobraźcie sobie samochód, który jeździ bez tankowania! Szacunkowe obliczenia pozwalają sądzić, że w mojej kieszeni pozostałaby niezły zwitek stuzłotówek (starczyłoby na nowy samochód). Jaka szkoda, że Papp już umarł.

Jak zapewne wszyscy już się domyślili, sam fakt, że samochody nie musiałyby podjeżdżać do stacji benzynowych, był wystarczającym powodem, aby rozwiązanie Pappa nie zostało, jak to się teraz ładnie mówi, skomercjalizowane.

TAJNE PATENTY l KNEBLE

Biorąc pod uwagę to, że Stany Zjednoczone przodują, tak w rozwoju przemysłowym, jak i w demokracji, a ostatnio w usilnym dbaniu o bezpieczeństwo obywateli, pozostańmy u nich i rozejrzyjmy się uważnie.

We wszystkich wymienionych tu przykładach można zaobserwować pewien schemat: ktoś wymyśla urządzenie, które może sprawić, że ludziom będzie żyło się taniej, zdrowiej i ogólnie lepiej, i z miejsca pojawiają się jakieś nieczyste siły usiłujące takiego niepoprawnego wynalazcę przywołać do porządku, nierzadko – ostatecznego.

Jak twierdzi Gary Vesperman w swoim artykule Działania na rzecz odtajnienia patentów związanych z energią (7), w Urzędzie Patentowym USA działa dziewięcioosobowy komitet oceniający nadsyłane patenty z punktu widzenia skutków, jakie niosą one dla bezpieczeństwa narodowego. Ponieważ „bezpieczeństwo narodowe" jest pojęciem bardzo pojemnym, wszystkie wynalazki dotyczące metod wytwarzania taniej energii są utajniane, a wynalazcę obowiązuje zakaz dalszej pracy nad wynalazkiem, publikacji oraz rozmów na jego temat pod groźbą kary 20 lat więzienia. Jeśli się nie podporządkujesz, to jesteś wrogiem narodu i idziesz siedzieć. Taki zakaz znany jest pod pojęciem „gag orders", co w wolnym tłumaczeniu znaczy „ordynacja kneblowa".

Dotyczy on zresztą nie tylko wynalazków związanych z energią, ale wszelkich, które mogłyby w jakiś sposób uniezależnić członków społeczeństwa od nadzoru władz. Spotkało to na przykład twórców urządzenia zabezpieczającego przed podsłuchiwaniem rozmów prowadzonych za pomocą radiostacji CB(8) oraz telefonów autorstwa Carla Kicolaia, Williama Raike'a, Carla Quale'a i Davida Millera z Seattle w stanie Washington. Agencja Bezpieczeństwa Narodowego (NSA) utajniła patent po sześciu miesiącach od jego wydania motywując to względami bezpieczeństwa państwa.

Podobne przepisy i działania są na porządku dziennym we wszystkich krajach świata. W Polsce również(9).

Wszędzie na świecie służby specjalne, wywiad wojskowy przejmują prawem kaduka dorobek badawczy, modele i dokumentacje wynalazczą. W Polsce stało się tak z Lucjanem Łągiewką i profesorem Gumułą.

Ta sprawa zresztą ma nieco komiczne zakończenie — oto po kilkutygodniowej wymuszonej współpracy z laboratorium wojskowym oddano modele, a nawet zapłacono p. Łągiewce za pracę. Naukowcy nie doszli do żadnych rozwiązań z pewnej prostej przyczyny — sam twórca nie dysponował jeszcze aparatem obliczeniowym pozwalającym na wykorzystanie odkrytego przez siebie zjawiska. Czy rzeczywiście jest to działanie na korzyść narodu, społeczeństwa? Wydaje się, że nie. Zresztą każdy czytelnik Nexusa ma już zapewne wyrobiony pogląd na ten temat.

Wróćmy na razie do Najwspanialszego Kraju Wzorcowej Demokracji (nie będę używa! akronimu, bo źle się kojarzy), czyli USA. Jak podał jakiś czas temu Don Kelly w Space Energy Journal, ilość utajnionych patentów „energetycznych" można szacować na około trzy tysiące. Z kolei Thomas Valone z Integrity Research Instilute, były rzecznik patentowy, ocenia, że ich liczba przekracza nawet cztery tysiące. Zgłaszający nie otrzymują numeru patentu, a wynalazcy (wynalazca nie koniecznie musi być zgłaszającym aplikację patentową) prawie nigdy nie otrzymują rekompensaty z tytułu używania ich wynalazków. I znów na usta ciśnie się pytanie:

W jakiż to sposób wynalazek pozwalający na domowe wytwarzanie energii elektrycznej może zagrozić bezpieczeństwu państwa?

BENEFICJENCI

A może tu nie chodzi tylko o bezpieczeństwo państwa? Zadajmy więc inne pytanie: „Qui bono?" – kto na tym korzysta? Lub raczej – kto może stracić na rozwoju tego typu nowych technologii indywidualnej produkcji energii? Odpowiedź jest prosta: przede wszystkim producenci energii i surowców energetycznych. No, bo, po cholerę, komu benzyna, jeśli wszyscy będą korzystali z silnika Pappa lub silnika na magnesy stałe? Po co komu okręgowe Zakłady Energetyczne i sieci przesyłowe, jeśli w garażu będzie się kręcić gustowny generator darmowej energii?

A że współpraca polityków i lobby energetycznego jest zjawiskiem trwałym i opartym na szafowaniu publicznym pieniądzem lekką ręką, to przecież wiadomo nie od dzisiaj. Jeśli ktoś myśli, że na Kapitolu siedzą wyłącznie reprezentanci narodu bez skazy na honorze, to jest bardziej naiwny niż przedszkolak. Już pierwsze słowa projektu ustawy energetycznej są wzorcowym przykładem hipokryzji : „Aby zwiększyć oszczędność energii, badania i rozwój..." bla, bla, bla…

Jaka oszczędność, jakie badania? Macie przecież ponad 4000 utajnionych patentów, które pozwalają na dostarczenie całej ludzkości energii za darmo! Cała ta ustawa zresztą to jeden gigantyczny podarunek społecznych środków dla przemysłu energetycznego.

Ta „współpraca" przemysłu energetycznego z politykami jest, nota bene, zawsze bardzo intratna. Zjawisko to jest globalne, a w samych Stanach Zjednoczonych związek między dotacjami na kampanię wyborczą a późniejszymi zwolnieniami podatkowymi i subwencjami jest prosty „jak drzewce dzidy", jak powiada Yarpen Zigrin, bohater powieści Andrzeja Sapkowskiego: oto 69,5 miliona dolarów przeznaczonych na kampanię zaowocowało 36 miliardami dolarów w postaci zwolnień i subwencji. To dopiero interes – ponad 52000 procent zysku. Handel narkotykami przy tym to jak zabawa w piaskownicy. I taka skuteczna ssawka z budżetu do prywatnych kieszeni ma przestać działać tylko dlatego, że ktoś sobie w garażu wymyślił jakiś generator punktu zerowego lub coś innego? Wolne żarty.(10)

A TAK WŁAŚCIWIE, O CO TU CHODZI?

To wszystko nie jesi takie proste i oczywiste, jak by się mogło wydawać. Dlatego proponuję teraz przyjrzenie się tym wzajemnym powiązaniom władzy, kapitału i interesów, które nie pozwalają nam żyć w lepszym, tańszym świecie. Jasno i prostymi słowami wyłożył to Peter Lindeman w swoim artykule The World of Free Energy”(11). Pozwolę sobie teraz na krótkie zaprezentowanie jego poglądów.

Współdziałają razem cztery, potężne siły, które tę niemoc powodują. Twierdzenie, że istnieje jakiś “generalny spisek”, by ukrywać i blokować te wynalazki, prowadzi do powierzchownego rozumienia świata i powoduje, że wcale nie czujemy się za ten stan odpowiedzialni. Nasz brak reakcji i obawa przed zmianami wywołujące pragnienie pozostawania w nieświadomości zawsze były interpretowane przez dwie z tych czterech sił jako „ciche przyzwolenie".

Parę słów wprowadzenia. Podstawy ekonomii wyróżniają trzy klasy przemysłu: kapitał, towary i usługi. Pierwszy, kapitał, ma trzy podklasy. Są to:

– dobra naturalne (wszelkiego rodzaju surowce, np. rudy żelaza, oraz źródła energii, np.energetyka wodna lub szyby naftowe);

– pieniądz (druk pieniędzy papierowych, oraz bicie monet – ta funkcja leży zazwyczaj w

gestii rządu);

– kredyt (pożyczanie pieniędzy na procent oraz wzrost wartości złożonych depozytów).

Wyraźnie z tego widać, że energia funkcjonuje w ekonomii w taki sam sposób, jak złoto, żelazo, drukowanie pieniędzy czy udzielanie kredytów przez bank. W większości krajów istnieje „monopol pieniężny". Wolno mi zarabiać tyle pieniędzy, ile chcę. ale tylko w banknotach emitowanych przez państwo. Nie mogę „mieć życzenia" by być wynagradzanym w złocie, certyfikatach albo innych rodzajach „pieniędzy". Ten „pieniężny monopol" znajduje się w rękach niewielkiej liczby banków, które należą do kilkunastu Najbogatszych Rodzin (np. w USA Rezerwa Federalna, mimo mylącej nazwy, jest bankiem prywatnym). W Polsce tak jeszcze nie jest, ale nie martw się. czytelniku, bowiem, czy rzeczywiście cieszymy się niezależnością NBP?

Owe NR (Najbogatsze Rodziny) mają w swoich planach przejęcie 100 procent zasobów kapitałowych świata, by móc kontrolować każdego poprzez umożliwianie (lub nie) dostępu do dóbr i usług.

Gdyby każdy obywatel Ziemi mógł mieć dostęp do niezależnego źródła bogactwa (w naszym przypadku są to urządzenia do wytwarzania taniej, darmowej energii), to te plany ległyby w gruzach raz na zawsze. Dlaczego? To proste – obecnie przyspieszenie lub zwolnienie gospodarki można wywołać manipulując stopa, procentową i przekrętami różnych bankowych „instrumentów pochodnych”. Jeśli jednak w ekonomii pojawiłoby się niezależne źródło kapitału (tu: energia) i każde przedsiębiorstwo lub osoba prywatna mogłaby zwiększać swój kapitał bez pożyczania go w banku, manipulacje stopami procentowymi nie dawałyby spodziewanych efektów.

Technologie wytwarzania darmowej energii zmieniają wartość pieniądza. Najbogatsi (wraz Kredytodawcami) nie chcą mieć konkurencji. Oni chcą nadal dzierżyć kontrolę nad podażą pieniądza. Dla nich darmowa energia to nie jest coś, co tylko należy tępić lub utajniać – takie coś powinno być zakazane raz na zawsze!

Tak wiec, uogólniając, pierwszą siłą nie dopuszczającą do rozprzestrzeniania się technologii darmowej energii są Najbogatsze Rodziny Świata wraz z swoimi bankami motywowane przez wyimaginowaną „władzę z boskiego nadania", chciwość i pazerną potrzebę kontrolowania wszystkiego (poza sobą, oczywiście). Używają zastraszania, podpaleń, zabójstw. Ośmieszają wynalazki i odkrycia przy pomocy „ekspertów" (sceptycy różnej maści i chowu). Wykupują prawa do technologii w celu jej utajnienia. Stosują szeroką gamę bodźców finansowych w celu manipulowania ewentualnymi zwolennikami nowoczesnych rozwiązań. Wspierają także z całych sił ogólne przekonanie o słuszności teorii naukowej głoszącej, że „darmowa energia" jest niemożliwa (bo prawa prawa termodynamiki itd).

Drugą siłą są rządy państw. W tym wypadku nie tyle chodzi o zagrożenie prawa wyłączności emisji pieniędzy, ile o zapewnienie „bezpieczeństwa narodowego". W stosunkach gospodarczych istnieje Złota Zasada: „Ten, kto ma złoto, ustanawia zasady". Podobnie jest w polityce, tyle że tu ta zasada ma brzmienie bardziej darwinowskie: „Przeżywa najlepiej przystosowany", przy czym „przystosowany" oznacza tu stronę najsilniejszą, która jest gotowa do stosowania najbardziej brutalnych i niegodziwych metod walki. Zastosowany może być absolutnie każdy dostępny środek w celu uzyskania i utrzymania przewagi nad „przeciwnikiem", przy czym „przeciwnikami" są wszyscy, bez względu na to, czy są uważani za przyjaciół, czy wrogów. Żaden rząd nigdy nie zrobi niczego, co mogło by dać rzeczywistą lub urojoną przewagę przeciwnikowi. Nigdy! To byłoby wszak narodowe samobójstwo. Dlatego jakiekolwiek działanie (jednostki, przedsiębiorstwa) na terenie kraju lub za granicą, które może być zinterpretowane jako dające przewagę przeciwnikowi, zawsze będzie uważane za „zagrożenie dla bezpieczeństwa państwa".

Darmowa energia to najgorszy koszmar dla każdego rządu. Twierdzi się otwarcie, że taka technologia to iskra, która może wywołać nieograniczony wyścig zbrojeń. Swobodny do niej dostęp może zakłócić równowagę sił w obecnej sytuacji międzynarodowej. Każde państwo chciałoby ją mieć na wyłączność i zrobi wszystko, aby inne państwa jej nie miały.Dlatego rząd jest, można by rzec, naturalnym przeciwnikiem takich technologii, a jego działania to typowa „samoobrona" i jest to działanie prowadzone na trzech płaszczyznach. Pierwsza – nie pozwala się na uzyskanie nadmiernej przewagi przez przeciwnika zewnętrznego. Druga – nie pozwala się na „anarchistyczne" działania jednostek uzyskujących zbyt wiele wolności w sferze wewnętrznej. Trzecia – ochrona dochodów z opodatkowania energii pochodzącej z dotychczasowych źródeł, nad którymi, przypomnijmy, państwo sprawuje wyłączną kontrolę.

Państwo używa do tego takich środków jak utrudnianie uzyskiwania patentów, zaś prawne i pozaprawne szykany w stosunku do wynalazców (oskarżenia kryminalne, areszt, kontrole finansowe, podsłuchy, groźby, kradzieże etc.) i cała gama utrudnień powodują, że produkcja i wprowadzanie na rynek urządzeń wytwarzających darmową energię jest w zasadzie niemożliwe.

Trzecia siła to wszelakiej maści nawiedzeni wynalazcy, szarlatani i różnego rodzaju oszuści. Na peryferiach przełomowych osiągnięć naukowych zalega cień nie wyjaśnionych anomalii i marginalnych odkryć, a w nim kryją się działania „niedocenionych" odkrywców oraz machlojki bezczelnych, pozbawionych skrupułów naciągaczy.

Dwie pierwsze siły zawsze wykorzystywały środki masowego przekazu (a właściwie masowej manipulacji) do prezentowania najgorszych przykładów z tej szarej strefy, aby, po pierwsze, odciągać uwagę społeczeństwa od tego typu zagadnień i, po drugie, dyskredytować prawdziwe osiągnięcia poprzez kojarzenie ich z oczywistymi oszustwami.

Czwarta siła to my sarni. Wyraźnie widać, jak ograniczone i podłe są powody działania pozostałych sił, ale te same motywacje tkwią również w nas samych.

Czyż tak samo jak Najbogatsze Rodziny nie pielęgnujemy w sobie fałszywego poczucia wyższości? Czy nie interesuje nas uzyskiwanie władzy nad innymi, zamiast nad sobą? Czy nie bylibyśmy gotowi zaprzedać się komukolwiek, jeśli cena byłaby dostatecznie wysoka? Czy jak nasz rząd nie zrobimy wszystkiego, by zapewnić sobie przetrwanie? Czy ogarnięci paniką w płonącym teatrze będziemy przejmować się losem słabszych, tych, których stratujemy w szaleńczym wyścigu do drzwi?

Czy nie zdarza się nam od czasu do czasu zamienić niewygodny dla nas fakt na miłą iluzję, jak to dzieje się u nawiedzonego wynalazcy? Nie uważamy, że dajemy z siebie więcej niż inni? Czy nie blokuje nas strach przed nowym, nawet jeśli obiecuje ono zmiany na lepsze?

Jak widać, wszystkie te cztery siły to różne aspekty tego samego procesu, który działa na różnych poziomach społecznych. I tak naprawdę istnieje tylko jedna siła ograniczająca wprowadzenie technologii niosących darmową energię – to motywowane najprymitywniejszymi instynktami zachowania zwierzęcej części naszej osobowości.

BOSKA OBFITOŚĆ

Z powyższej analizy wynika, że technologie darmowej energii są niczym innym jak zewnętrznym przejawem „Boskiej Obfitości”. Że jest to silnik ekonomii oświeconego społeczeństwa, którego członkowie dobrowolnie odnoszą się do siebie z szacunkiem, gdzie każdy może mieć tyle, ile mu naprawdę potrzeba, i nie musi z pożądaniem spoglądać na dobra należące do sąsiada. Gdzie wojna i przemoc staja się zachowaniami społecznie nie akceptowalnymi, a różnice między ludźmi są nie tylko tolerowane, ale wręcz pożądane.

Pojawienie się tych technologii jest zwiastunem prawdziwie cywilizowanego wieku. To zdarzenie epokowe w historii tej cywilizacji. By stosować te technologie, nikt nie może się zadłużać, nikt nic może dzięki nim stawać się bogatym i przewodzić światu. To dar, który zmusza nas do wzięcia odpowiedzialności za nasze czyny i wykazania się zdolnością do samoograniczania. kiedy zaistnieje potrzeba. Świat w stanie takim, w jakim znajduje się obecnie, nie może dysponować darmową energią, jeśli się nie przeobrazi.

Nie należy żywić nadziei, że pozbawione pierwiastka duchowego „ludzkie zwierzę" może bezkarnie posiąść taki dar. Będzie bowiem robić to, co czyniło dotychczas – będzie usiłowało uzyskać przewagę w bezlitosny sposób, posuwając się do niszczenia innych i siebie zarazem.

Gdy cofając się wstecz czytamy Raport Rzymski, staje się jasne, że Najbogatsze Rodziny wiedzą o tym od dawna. Życie w świecie darmowej energii jest ich celem, lecz my, reszta społeczności, w nie jesteśmy w nim uwzględniani. To zresztą nic nowego. Władza zawsze miała tendencje do traktowania społeczeństwa jako swojej „własności”.

NADZIEJA?

To co jest nowe w tej sytuacji, to fakt, że możemy teraz porozumiewać się ze sobą w sposób tak łatwy, jak nigdy przedtem. Internet ofiarowuje nam, Czwartej Sile, okazję, aby pokonać usiłowania, których celem jest niedopuszczenie na rynek darmowej energii przez pozostałe Siły.

Możliwości poznawania różnych rozwiązań, możliwości komunikacyjne (mimo różnych Echelonów) są nie do przecenienia i każdy, komu leży na sercu dobro innych ludzi, bez względu na wyznanie, kolor skóry i miejsce zamieszkania, powinien uważnie śledzić doniesienia na temat pojawiających się rozwiązań i wspierać je w każdy możliwy sposób.

Tylko wspólne tego typu działania, na które składają się wszystkie indywidualne inicjatywy, mogą wymusić to, że technologie ofiarowujące tanią/darmową energię znajdą swoje miejsce w naszych domach. Pomóc w tym mogą nawet działania, które wydają się naiwne, jak na przykład zadawanie „głupich" i niewygodnych pytań swoim reprezentantom we władzach, a także uważne obserwowanie poczynań firm będących monopolistami w dostawach energii. Nie zawsze będzie to proste, ale też nie wymaga zbyt wiele wysiłku. Jedynie czasami trochę odwagi.

Jako ciekawostkę podam, że w moim mieście zmieniono gaz na lepszy, „bardziej energetyczny" i, co za tym idzie, droższy.

Wiązało się to z szeroką akcją wymiany dysz w urządzeniach gazowych. Na koszt (he, he) spółki gazowniczej. Miało być pięknie a wyszło jak zawsze. Rachunki płacę większe, a czas zagotowania czajnika wody wydłużył się o jedną czwartą. (Przyznam, że sam jeszcze nic z tym nie zrobiłem. A chyba by należało.)

Prośba na koniec: Czytelniku! obserwuj, oceniaj i nie siedź cicho. Twoją bronią jest podstawowe pytanie: DLACZEGO?

Przemysław Ilukowicz

Przypisy:

1. Christopher Bird. An Invisible Galaxy of Inventions, e–mail na stronie

http://fourthdimension.freeyellow.com/NoConspiracy.htm.

2. Tamże.

3. Patrz strona http://www.spiritofmaat.com/archive/feb2/vesprman.htm

4. Jorma Hyypia, „Silnik napędzany energią stałych magnesów". Nexus, nr 3 (5), maj–czerwiec 1999.

5. John Dodd. Zadziwiający magnetyczny silnik Kohei Minato, Nexus, nr 5 (37). wrzesień–październik

2004.

6. Patrz strona hitp://www.rexresearch.com/papp/2pappats.htm oraz http://www.infinite–energy.com

7. Patrz strona http://www.spiritofmaat.com/archive/feb2/vesprman.htm

8. Skrót od Citizen Band – zakres fal przeznaczonych do indywidualnego kontaktu między obywatelami

(np. prawie każda ciężarówka w USA, a u nas także, jest wyposażona w nadajnik CB).

9. Ustawa Prawo Własności Przemysłowej z 30 czerwca 2000 roku. an. 56–62 oraz art. 167–169.

Dziennik Ustaw, nr 108. 17 lipca 2002 roku.

10. Swoją drogą podatnik amerykański jest bardzo cierpliwy. A teraz na to mu przyszło, że nawet jeśli straci cierpliwość, to za wysoko nie podskoczy, bo władze mają swoje ustawy antyterrorystyczne i podskakujących będzie można zamknąć za „zamachiwanie się” na porządek społeczny. Czy coś ci to przypomina, drogi Czytelniku? Zwracam się do urodzonych przed 1975 rokiem.

11. Patrz strona http://www.spiritofmaat.com.

Nowa era w molekularnej biologii

Nowa era w molekularnej biologii: Precyzyjne poprawianie genomu metodą CRISPR/Cas9.

Opracowanie wydajnej i niezawodnej metody, aby uczynić precyzyjne i wycelowane zmiany w genomie żywych komórek jest odwiecznym marzeniem badaczy biomedycznych. Niedawno, znaczne podniecenie wywołało nowe narzędzie oparte na bakteryjnym białku Cas9 (CRISPR-associated protein-9 nuclease) ze Streptococcus pyogenes [1]. W ciągu wielu lat pojawiło się wiele prób manipulacji funkcją genu, w tym przez homologiczną rekombinację [2] i przez interferencyjne RNA (RNAi) [3]. RNAi w szczególności stało się głównym laboratoryjnym narzędziem umożliwiającym niedrogą i wydajną metodę przeegzaminowania funkcji genu [4,5], niemniej jednak metoda ta posiada ograniczenia przez dostarczanie jedynie czasowego hamowania funkcji genu, a także zewzględu na nieprzewidywalnych skutki uboczne [6]. Inne podejścia do opracowania wycelowanej modyfikacji genomu – nukleazy z palcami cynkowymi (ZFNs, zinc-finger nucleases)[7] i nukleazy efektorowe podobne do aktywatora transkrypcji (TALENs, transcription-activator like effector nucleases) [8] umożliwiały badaczom generowanie stałych mutacji przez wprowadzenie podwójnoniciowych pęknięć w DNA w celu aktywacji szlaku reparacyjnego. Te podejścia jednak są kosztowne i czasochłonne do wykonania, ograniczając ich szerokie stosowanie w szczególności w badaniach na wielką skalę i o wysokiej wydajności.

Biologia Cas9

U niektórych bakterii i arche, funkcje palindromicznych powtórzeń typu CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) i genów towarzyszących CRISPR

 

Rys. 1. Cas9 in vivo: Bakteryjna odporność adaptacyjna. W fazie pozyskania (ataku), obce DNA jest inkorporowane do bakteryjnego genomu w miejscu CRISPR. Wówczas miejsce CRISPR, wraz z obcym DNA ulega transkrypcji i procesingowi do crRNA podczas biogenezy crRNA. Podczas interferencji kompleks endonukleazy Cas9 z crRNA i oddzielnym tracrRNA przecina obce DNA zawierające 20-nukleotydową, komplementarną sekwencję crRNA sąsiadującą z sekwencji PAM (Protospacer-adjacent motif)(Rysunek nie jest narysowany w skali).

 

(Cas, CRISPR-associated) pełnią ważną rolę w adaptacyjnej odporności, dającej organizmowi możliwość odpowiedzi i eliminacji inwazyjnego materiału genetycznego. Początkowo te palindromiczne powtórzenia (CRISPR) odkryto u E. coli w latach 1980 [9], ale funkcji ich nie poznano aż do 2007 kiedy to Barrangou i współpracownicy, którzy wykazali, że S. thermophilus może uzyskać odporność na bakteriofagi przez integrację fragmentu genomu infekcyjnego wirusa w miejscu CRISPR [10].

Zostały zidentyfikowane trzy typy mechanizmów CRISPR, z których typ II jest najbardziej badany. W tym wypadku inwazyjne DNA z wirusów lub plazmidów jest cięte na małe fragmenty i wcielane w miejscu CRISPR między serią krótkich powtórzeń (ok. 20 bps). Miejsca te ulegają transkrypcji i wtedy transkrypty są procesowane dając małe RNA (crRNA , CRISPR RNA), które są używane do wskazania drogi dla efektorowych endonukleaz, które są wycelowane w inwazyjne DNA bazując na komplementarności sekwencji (Rys. 1)[11].

W eksperymentach z uszkodzeniem genu i jego ratowaniem wykazano, że jedno białko CAS, a mianowicie Cas9 (znane również jako Csn1) jest kluczowym graczem w pewnych mechanizmach CRISPR (specyficznie w układzie CRISPR typu II). Typ II mechanizmu CRISPR jest unikalnym mechanizmem w porównaniu z innymi układami CRISPR, jako że jedynie jedno białko Cas (Cas9) jest konieczne do wyciszenia genu [12]. W układach typu II, Cas9 uczestniczy w procesowaniu crRNA [12] i jest odpowiedzialne za destrukcję docelowego DNA [11]. Funkcja Cas9 w obu tych stopniach polega na obecności dwóch domen nukleazowych, domenie nukleazy podobnej do RuvC (RuvC-like nuclease) usytuowanej na N-końcu i domenie nukleazy podobnej do HNH (HNH-like nuclease), która jest zlokalizowana w regionie środkowym białka [13].

Aby osiągnąć rozpoznanie specyficznego miejsca na DNA i jego przeci ęcie, Cas9 musi być skompleksowana zarówno z crRNA, jak i oddzielnym aktywowanym trans crRNA (tracrRNA, lub trRNA, separate trans-activating crRNA), które jest częściowo komplementarne do crRNA [11]. To tracrRNA jest konieczne dla dojrzewania crRNA z pierwotnego transkryptu kodującego wiele pre-crRNA. To dojrzewanie odbywa się w obecności RNAseIII i Cas9 [12].

Podczas destrukcji docelowego DNA, obie domeny nukleazowe białka, a więc podobne do HNH i RuvC przecinają obie nici DNA, generując podwójnoniciowe pęknięcia (DSBs, double-stranded breaks) w miejscach definiowanych przez 20-nukleotydową sekwencję w obrębie towarzyszącego transkryptu crRNA [11,14]. Domena HNH przecina nić komplementarną, podczas gdy RuvC przecina nić niekomplementarną.

Podwójnoniciowa, endonukleazowa aktywność Cas9 również wymaga, aby krótka konserwatywna sekwencja (2-5 nukleotydów), znana jako motyw towarzyszący protospacerowi (PAM, protospacer-associated motif), następująca bezpośrednio zaraz za komplementarną sekwencją na końcu 3’ crRNA [15]. W rzeczywistości, nawet całkowicie komplementarna sekwencja jest ignorowana przez Cas9-RNA w nieobecności sekwencji PAM [16].

Cas9 i CRISPR jako nowe narzędzie biologii molekularnej.

Prostota nukleazy CRISPR typu II, z jedynie trzema komponentami (Cas9, crRNA i trRNA) czyni ten system skłonny do adaptacji do edytowania genomu. Douda i Charpentier [11] zdali sobie sprawę z ogromnego potencjału tego odkrycia. Opierając się na wcześniej opisanym układzie CRISPR typu II, autorzy opracowali uproszczony system dwu komponentów przez połączenie trRNA i crRNA z pojedynczą syntetyczną cząsteczką RNA pojedynczo nakierowaną (sgRNA, single guide RNA). Wykazano, że Cas9, zaprogramowane przez sarna jest co najmniej tak efektywna jak Cas9 programowane przez oddzielnie trRNA i crRNA w kierowaniu zmian w genie docelowym (Rys. 2A).

Do dziś trzy różne warianty nukleazy Cas9 zostały zaadaptowane w protokole edytowania genomu. Pierwszy jest Cas9 typu dzikiego, który może przecinać w specyficznym miejscu podwójnoniciowe DNA (DSB, double stand break), co aktywuje reperujący mechanizm. To pęknięcie DCB może być zreperowane przez komórkowy szlak NHEJ (Non-Homologous End Joining) niehomologicznego łączenia końców [17], skutkujący w inercji lub delecji (indels), który może zniszczyć w tym miejscu docelowy gen. Alternatywnie, jeśli dostarczymy matrycę donorową z homologią do docelowego miejsca, DSB może być zreperowane przez szlak HDR (homology-directed repair) reperacji kierowanej homologią, umożliwiając precyzyjną wymianę mutacji (Rys. 2A)[17,18].

Cong i współpracownicy [1] poszli krok dalej i zastosowali system Cas9 do zwiększenia precyzji przez opracowanie formy mutacji, znanej jako Cas9D10A, posiadającej jedynie aktywność nikazy, to znaczy aktywności posiadającej zdolność pęknięcia tylko jednej nici DNA i przez to nie aktywuje mechanizmu NHEJ. Zamiast tego, kiedy dostarczymy homologiczną matrycę do reperacji, reperacja DNA jest przeprowadzana z wysoką precyzją jedynie przez mechanizm HDR, co powoduje redukcję mutacji indel [1,11,19].

Zmutowane białko Cas9D10A jest jeszcze bardziej pożądane w sytuacji, kiedy miejsce docelowej mutacji jest przeprowadzane przez kompleksy Cas9 zaprojektowane do generacji pęknięć (nicks) sąsiedniego DNA [20] (Rys. 2B dostarcza więcej detali na temat aktywności „parowanej nikazy”).

Trzeci wariant jest białko Cas9, nie posiaające aktywności nukleazowej (dCas9 na Rys. 2C) [21]. Mutacja H940A w domenie HNH i D10A w domenie RuvC inaktywuje aktywność cięcia DNA, ale nie zapobiega wiązaniu DNA [11,22]. Z tego powodu wariant ten może być użyty do znalezienia miejsca o specyficznej sekwencji w dowolnym regionie genomu bez jego przecięcia. Zamiast tego, przez fuzję z różnymi domenami eżektorowymi, dCas9 może być użyte jako narzędzie do albo wyciszania genu lub do jego aktywowania [21,23-26]. Co więcej, to może być użyte jako narzędzie do wizualizacji. Na przykład, Chen i współpracownicy użyli fuzję dCas9 z białkiem fluorescencyjnym EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) do wizualizacji sekwencji powtarzających się w pojedynczym sarna lub niepowtarzających się miejsc używając transkrypt wielokrotnego sgRNA [27].

 

Rys. 2. Zastosowania systemu CRISPR

A. Nukleaza Cas9 typu dzikiego przecina podwójnoniciowe DNA w specyficznym miejscu aktywując mechanism reperacji podwójnociowego pęknięcia DNA (NHEJ, Non-Homologous End Joining). W nieobecności homologicznej matrycy do reperacji DNA, niehomologiczne łączenie końców może powodować insercje/delecje (indel), które mogą zniszczyć sekwencję docelową. Alternatywnie, można wykonać precyzyjne mutacje i wstawki przez dostarczenie homologicznej matrycy i wykorzystanie homologicznego bezpośredniego mechanizmu reperacji (HDR, homology-directed repair). B. Zmutowana nukleaza Cas9 powoduje specyficzne w stosunku do miejsca pęknięcia w jednej z nici DNA (nicks ). Dwa sgRNA mogą być użyte dla wprowadzenia naprzemiennego podwójno-niciowego pęknięcia, które podlega reperacji kierowanej przez homologię. C. Zmutowany Cas9, nieposiadajacy aktywności przecinania DNA może być połączony (ulec fuzji) z różnymi domenami efektorów umożliwiającymi specyficzną lokalizację. Takimi efektorami mogą być aktywatory lub represory transkrypcji, a także białka fluoroscencyjne.

Sprawa wydajności i niechcianych mutacji

Porawianie wydajności, lub procentu osiągnięcia pożądanych mutacji, jest jednym z najważniejszych parametrów w ocenie narzędzi edytowania genomu. Patrząc na wydajność Cas9 porównujemy ten system ze znanymi metodami, takimi jak TALEN lub ZFN [8]. Na przykład w komórkach ludzkich, zaprojektowana modyfikacja z użyciem metody ZFN lub TALEN może być osiągnięta z wydajnością 1-50% [29-31]. W przeciwieństwie do tego, system Cas9 umożliwia osiągnięcie żądanej mutacji z wydajnością powyżej 70%, u ryby Danio [32], w roślinach [33] i w granicach 2-5% w indukowanych komórkach macierzystych [34]. Dodatkowo, Zhou i współpracownicy byli w stanie podnieść wydajność do 78% w jednokomórkowym zarodku myszy i osiągnęli wydajną transmisję zarodkową przez użycie dwóch sgRNA do jednoczesnej zmiany indywidualnego genu [35].

Szeroko stosowana metoda identyfikacji mutacji to test detekcji z użyciem T7 endonukleazy I [36,37] (Rys. 3). Test ten wykrywa heterodupleks DNA, który powstaje w wyniku hybrydyzacji nici DNA, posiadającą żądaną mutację z nicią DNA typu dzikiego [37]. 

 

Rys. 3. Test wydajności docelowej mutacji za pomoca T7 endonukleazy I.

Genomowe DNA jest powielone metodą PCR przy pomocy primerów optaczających modyfikowane miejsce. Produkty PCR są następnie denaturowane i powtórnie hybrydyzowane dając trzy możliwe struktury. Dupleksy zawierające mutacje są trawione przez T7 endonukleazę I. Po tym trawieniu DNA jest poddawane elektroforezie i oddzielane, a fragmenty analizowane w celu określenia wydajności celowej mutacji.

Innym ważnym parametrem jest zdarzenie niechcianej (off-target) mutacji. Takie mutacje mogą powstawać prawdopodobnie w miejscach, które posiadają różnice jedynie kilku nukleotydów w porównaniu do sekwencji pierwotnej, a mogą powstać o ile znajdują się one w sąsiedztwie do sekwencji PAM. Jest to spowodowane faktem, że Cas9 może tolerować niedokładność (mismatch) sekwencji sięgającą aż 5-ciu zasad wewnątrz regionu „protospacer” [36] lub różnicę jednej zasady w sekwencji PAM [38]. Niechciane mutacje jako skutek uboczny ogólnie jest trudno wykryć, co wymaga zsekwencjonowania całego genomu, aby je całkowicie wykluczyć.

Niedawne ulepszenia w systemie CRISPR wprowadzone, aby zredukować niechciane mutacje zostały zrobione przez użycie krótszego gRNA (skróconego w obrębie sekwencji pochodnej cRNA) lub przez dodanie dwóch dodatkowych nukleotydów guaninowych (G) na końcu 5’ [28, 37]. Innym sposobem, którym próbowano minimalizować efekt niechciany (off-target) jest użycie „paired nickases” [20]. Strategia ta używa D10ACas9 i dwa sgRNA komplementarne do sąsiedniego obszaru na przeciwnych niciach miejsca docelowego (Rys. 2B). Pomimo że to indukuje DSB na DNA docelowym, to zakłada się, że spowoduje to tylko pojedyncze pęknięcie w lokalizacji poza miejscem docelowym i w ten sposób skutkuje minimalnymi mutacjami niechcianymi (off-target).

Przez komputerowe wspomaganie w redukowaniu mutacji niechcianych, wiele grup opracowało narzędzia z użyciem sieci internetowej dla ułatwienia identyfikacji potencjalnych miejsc docelowych dla CRISPR i oceny ich potencjalnego przecięcia poza miejscem docelowym. Przykłady te obejmują CRISPR Design Tool [38] i ZiFiT Targeter, Version 4.2 [39,40].

Aplikacje jako narzędzia edytowania genomu i namierzanie genomu.

W następstwie początkowej demonstracji w 2012 roku [9], system CRISPR/Cas9 znalazł szerokie zastosowanie. System ten został z sukcesem użyty w namierzeniu ważnych genów w wielu liniach komórkowych i organizmach, w tym ludzkich [34], bakteryjnych [41], ryby Danio (zebrafish) [32], C. elegans [42], roślin [34], Xenopus tropicalis [43], drożdży [44], Drosophila [45], małp [46], królika [47], świni [42], szczura [48], i muszy [49]. Kilka grup badaczy wykorzystało tę metodę do wprowadzenia pojedynczych mutacji (delecji lub insercji) do poszczególnego genu docelowego poprzez pojedynczy gRNA [14,21,29]. Używając zamiast tego nukleazę Cas9 kierowaną przez parę gRNA, to jest również możliwe, aby indukować duże delecje lub rearanżację genomu, takie jak inwersje, lub translokacje [50]. Niedawne podniecającym opracowaniem jest użycie wersji dCas9 w systemie CRISPR/Cas9 do kierowania domeny białka w regulacji transkrypcji [26,51,52], epigenetycznej modyfikacji [25] i wizualizacji mikroskopowej specyficznego miejsca na genomie [27].

System CRISPR/Cas9 wymaga jedynie powtórnego opracowania crRNA, tak aby zmienić specyficzność docelową. Taka korzyść jest przeciwieństwem innych narzędzi edytujących geny, w tym stosujących palce cynkowe i TALEN, gdzie wymagane jest powtórne opracowanie interfejsu białko-DNA. Co więcej, CRISPR/Cas9 umożliwia szybkie przeegzaminowanie całego genomu w celu znalezienia funkcji genu przez wygenerowanie dużej biblioteki gRNA [51,53] w celu przesiewowego badania genomu.

Przyszłość CRISPR/Cas9

Dzięki prostocie, wysokiej wydajności i zróżnicowaniu systemu nastąpił ogromny postęp w rozwoju Cas9 w kierunku zestawu narzędzi dla badań biologii komórkowej i molekularnej. Z powodu możliwości systemu nukleazy obecnie dostępny w precyzyjnej inżynierii genomu, potencjał systemu CRISP/Cas9 sięga poza przecinanie DNA i jego użyteczność w rekrutacji białka do specyficznego miejsca na genomie prawdopodobnie jest ograniczone jedynie przez naszą wyobraźnię.

Piśmiennictwo

1. Cong L., et al. (2013) Science, 339, 819–823.
2. Capecchi, M.R. (2005) Nat. Rev. Genet. 6, 507–512.
3. Fire, A., et al. (1998) Nature, 391, 806–811.
4. Elbashir, S.Mm, et al. (2002) Methods, 26, 199–213.
5. Martinez, J., et al. (2003) Nucleic Acids Res. Suppl. 333.
6. Alic, N, et al. (2012) PLoS One, 7, e45367.
7. Miller, J., et al. (2005) Mol. Ther. 11, S35–S35.
8. Mussolino, C., et al. (2011) Nucleic Acids Res. 39, 9283–9293.
9. Ishino, Y., et al. (1987) J. Bacteriol. 169, 5429–5433.
10. Barrangou, R., et al. (2007). Science, 315, 1709–1712.
11. Jinek, M., et al. (2012) Science, 337, 816–821.
12. Deltcheva, E., et al. (2011) Nature, 471, 602–607.
13. Sapranauskas, R., et al. (2011) Nucleic Acids Res. 39, 9275–9282.
14. Nishimasu, H., et al. (2014) Cell, doi:10.1016/j.cell.2014.02.001
15. Swarts, D.C., et al. (2012) PLoS One, 7:e35888.
16. Sternberg, S.H., et al. (2014) Nature, doi:10.1038/nature13011.
17. Overballe-Petersen, S., et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110,19860–19865.
18. Gong, C., et al. (2005) Nat. Struct. Mol. Biol. 12, 304–312.
19. Davis, L., Maizels, N. (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 111, E924–932.
20. Ran, F.A., et al. (2013) Cell, 154, 1380–1389.
21. Qi, L.S., et al. (2013) Cell, 152, 1173–1183.
22. Gasiunas, G., et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 109, E2579–2586.
23. Maede, M.L., et al. (2013) Nat. Methods, 10, 977–979.
24. Gilbert, L.A., et al. (2013) Cell, 154, 442–451.
25. Hu, J., et al. (2014) Nucleic Acids Res. doi:10.1093/nar/gku109.
26. Perez-Pinera, P., et al. (2013) Nat. Methods, 10, 239–242.
27. Chen, B., et al. (2013) Cell, 155, 1479–1491.
28. Seung, W., et al. (2014) Genome Res. 24, 132–141.
29. Miller, J.C., et al. (2011). Nat. Biotechnol. 29, 143–148.
30. Mussolino, C., et al. (2011). Nucleic Acids Res. 39, 9283–9293.
31. Maeder, M.L., et al. (2008) Mol. Cell, 31, 294–301.
32. Hwang, W.Y., et al. (2013) PLoS One, 8:e68708.
33. Feng, Z., et al. (2013) Cell Res. 23, 1229–1232.
34. Mali, P., et al. (2013) Science, 339, 823–826.
35. Zhou, J., et al. (2014) FEBS J. doi:10.1111/febs.12735.
36. Fu, Y., et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31, 822–826.
37. Fu, Y., et al. (2014) Nat Biotechnol. doi: 10.1038/nbt.2808.
38. Hsu, P.D., et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31, 827–832.
39. Sander, J.D., et al. (2007) Nucleic Acids Res. 35, W599-605.
40. Sander, J.D., et al (2010) Nucleic Acids Res. 38, W462–468.
41. Fabre, L., et al. (2014) PLoS Negl. Trop. Dis. 8:e2671.
42. Hai, T., et al. (2014) Cell Res. doi: 10.1038/cr.2014.11.
43. Guo, X., et al. (2014) Development, 141, 707–714.
44. DiCarlo, J.E., et al. (2013) Nucleic Acids Res. 41, 4336–4343.
45. Gratz, S.J., et al. (2014) Genetics, doi:10.1534/genetics.113.160713.
46. Niu, Y., et al. (2014) Cell, 156, 836–843.
47. Yang, D., et al. (2014) J. Mol. Cell Biol. 6, 97-99.
48. Ma, Y., et al. (2014) Cell Res. 24, 122–125.
49. Mashiko, D., et al. (2014) Dev. Growth Differ. 56, 122–129.
50. Gratz, S.J., et al. (2013) Fly, 249.
51. Mali, P., et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31, 833–838.
52. Cheng, A.W., et al. (2013) Cell Res. 23, 1163–1171.
53. Koike-Yusa, H., et al. (2013) Nat. Biotechnol. doi: 10.1038/nbt.2800.
54. Sander, J.D., and Joung, J.K. (2014) Nat Biotechnol. doi:10.1038/nbt.2842.

From NEB expressions Issue I, 2014
Article by Alex Reis, Ph.D., Bitesize Bio
Breton Hornblower, Ph.D., Brett Robb, Ph.D. and George Tzertzinis, Ph.D., New England
Biolabs, Inc.

https://www.neb.com/tools-and-resources/feature-articles/crispr-cas9-and-targeted-genome-editing-a-new-era-in-molecular-biology#!

Wybrane aktualne publikacje:

Pulecio J, Verma N, Mejía-Ramírez E, Huangfu D, Raya A. 2017. CRISPR/Cas9-Based Engineering of the Epigenome. Cell Stem Cell. 21(4): 431-447.

Maxwell KL. 2017. The Anti-CRISPR Story: A Battle for Survival. Mol Cell. 68(1): 8-14.

Hess GT, Tycko J, Yao D, Bassik MC. 2017. Methods and Applications of CRISPR-Mediated Base Editing in Eukaryotic Genomes. Mol Cell.  68(1): 26-43.

Murugan K, Babu K, Sundaresan R, Rajan R, Sashital DG. 2017. The Revolution Continues: Newly Discovered Systems Expand the CRISPR-Cas Toolkit. Mol Cell.  68(1): 15-25.

Zhang Y, Mu W, Wang H. 2017. Gene editing in T cell therapy. J Genet Genomics.  44(9): 415-422.

Liu C, Zhang L, Liu H, Cheng K. 2017. Delivery strategies of the CRISPR-Cas9 gene-editing system for therapeutic applications. J Control Release. 266: 17-26.

Jamal M, Ullah A, Ahsan M, Tyagi R, Habib Z, Khan FA, Rehman K. 2017. Treating Genetic Disorders Using State-Of-The-Art Technology. Curr Issues Mol Biol. 26: 33-46.

Gundry MC, Dever DP, Yudovich D, Bauer DE, Haas S, Wilkinson AC, Singbrant S. 2017. Technical considerations for the use of CRISPR/Cas9 in hematology research. Exp Hematol. 54: 4-11.

Kwarteng A, Ahuno ST, Kwakye-Nuako G. 2017. The therapeutic landscape of HIV-1 via genome editing. AIDS Res Ther. 14(1): 32.

Wang HX, Li M, Lee CM, Chakraborty S, Kim HW, Bao G, Leong KW. 2017. CRISPR/Cas9-Based Genome Editing for Disease Modeling and Therapy: Challenges and Opportunities for Nonviral Delivery. Chem Rev. 117(15): 9874-9906.

Mei Y, Wang Y, Chen H, Sun ZS, Ju XD. 2016. Recent Progress in CRISPR/Cas9 Technology. J Genet Genomics. 43(2): 63-75.

Yang HC, Chen PJ. 2017. The potential and challenges of CRISPR-Cas in eradication of hepatitis B virus covalently closed circular DNA. Virus Res. 2017 Jun 13. pii: S0168-1702(17) 30279-4.